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内源性干扰对免疫分析的影响

来源: 时间:2018-01-03

免疫分析受多种因素影响,包括内源性干扰。内源性干扰可引起假性结果,导致误诊或不必要的检查、治疗。大部分学者是在试验结果可疑或与临床不符时,回顾性地寻找干扰原因,通过不同方法验证内源性干扰存在,然后设法消除干扰,再重新测定。目前,对内源性干扰的机制、消除方法等问题已有所了解但还不是很成熟,有待进一步研究。

下面对内源性干扰的类型、干扰机制以及消除方法进行总结。

自身抗体

1.产生原因 自身抗体是针对自身抗原成分产生的一类抗体,可能与恶性疾病或自身免疫紊乱有关。常见的影响免疫分析的自身抗体有抗甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、抗甲状腺激素抗体、抗甲状腺激素受体抗体、抗胰岛素抗体等。

2。产生的干扰及干扰机制 自身抗体的出现改变了相应抗原的浓度,可产生假性结果,影响程度和游离抗原与抗原-抗体复合物的比例、抗体性质、反应类型及试剂成分有关。

3。解决方法  1)测定前用解离液将抗原-抗体复合物解离。2)当怀疑结果受自身抗体干扰时,换一种方法进行检测。3)聚乙二醇(PEG)处理去除抗体。4)凝胶过滤或PEG预处理可消除巨泌乳素干扰。5)琼脂糖G蛋白沉淀法可降低干扰。6)用其他检查或其他检验结果验证结果的准确性。

异嗜性抗体(HAb

1. 产生原因  HAb的产生可能与使用动物蛋白或动物IgG进行治疗、接种疫苗、接触动物、进食受污染的食品或未经高温消毒的鲜奶有关。单克隆抗体治疗的发展使HAb干扰问题日益普遍。

2. 产生的干扰及干扰机制 文献报道,人绒毛膜促性腺激素(hCG)、前列腺特异性抗原(PSA)、促黄体生成激素(LH)、甲状旁腺激素(PTH)、降钙素、CA125等检测受到HAb的干扰。HAb还可干扰嗜铬粒蛋白A、类胰蛋白酶的测定,也可引起肌红蛋白、TSH假性增高。另有HAb干扰导致Tg未被检出的报道。

3. 消除方法  1)封闭HAb。异嗜性抗体封闭剂(HBR)、免疫球蛋白抑制剂(IIR)、异嗜性抗体封闭管(HBT)可消除HAb干扰。2)聚乙二醇预处理沉淀抗体。3)对热稳定的组分加热处理。4)利用基因工程重组单链抗体片段做捕获抗体。5)以非IgG亲和蛋白作固相抗体或酶标抗体。6)用鸡抗体作为固相抗体和检测抗体。7)去除分析抗体Fc片段,改变分析抗体的结构或进行化学修饰。8)使用不受HAb影响的方法进行分析。9)用其他类型标本进行测定加以验证,如HAb引起血hCG假性增高,可预定尿液hCG。10)利用不同IgG亚类作抗体可降低HAb干扰。11)重组单克隆IgY作试剂抗体能防止干扰现象。

人抗动物抗体(HAAA

1. 产生原因  使用鼠抗体进行诊断或治疗、接触鼠类、疫苗接种、输血、母婴传播可导致人抗鼠抗体(HAMA)的产生。

2。 产生的干扰及干扰机制 HAMA主要干扰心脏标志物、甲状腺功能测试、毒品、肿瘤标志物(如CEAPSA)、PTH、人绒毛膜促性腺激素、风疹病毒IgM、性激素等,引起假性结果。

HAMA通过不同机制产生不同的干扰。在双位夹心免疫测定法中,HAMA可桥联捕获抗体及检测抗体引起假阳性干扰。HAMA作用于检测抗体,也可导致检测结果偏高。HAMA可分别与捕获抗体和检测抗体结合,使其不能与待测物结合而引起假阴性。HAMA也可只结合捕获抗体甚至覆盖整个表面,引起部分或完全封闭作用,抗原无法结合捕获抗体,引起假阴性干扰。在竞争法测定中,高浓度HAMA也可产生干扰。

3。消除方法   1)预防HAMA的产生,接受鼠源性抗体诊断或治疗前、中、后期,使用免疫抑制剂可有效防止HAMA的产生;或用Fab’2片段、化学修饰可降低其免疫原性。2)使用IIR等封闭剂预处理。3)用Fab’2片段代替完整的IgG或用单克隆嵌和抗体作捕获抗体或检测抗体。4)使用鸡抗体作捕获抗体或检测抗体。5)聚乙二醇预处理。6)对热稳定分析物加热处理消除血清中的HAMA。7)加入鼠IgG预孵育可中和标本中的HAMA8)改变试剂中动物抗体种类,如以羊抗体代替鼠抗体。

类风湿因子(RF

1。 产生原因   RF是一类以自身变性IgG为靶抗原的抗体,是一种经典的人抗人免疫球蛋白。RF主要存在于类风湿关节炎患者血浆中,也可存在于其他疾病患者及3%-5%健康者中。

2。 产生的干扰及干扰机制   RF作用与异嗜性抗体相似。RFELISA法检测D-二聚体,乙型肝炎标志物等干扰明显,也可干扰TSHcTnl、甲状腺激素、性激素结合球蛋白(SHBG)、脂肪酶、TORCH IgM抗体、CA19-9等项目的测定。

RF可与IgG Fc片段结合,因此RF能桥联捕获抗体和检测抗体从而引起干扰。在ELISA测定试验中,RF可吸附至固相抗体上,然后直接与酶结合物反应而显色,从而导致假阳性。RF干扰在捕获法测定IgM抗体尤为突出,与IgG发生聚集作用也是RF干扰机理之一。

3。 消除方法  1IgM抗体滴度较高,稀释法可避免RF干扰IgM抗体测定。2)将经热变性的动物IgG与聚苯乙烯微球结合后加入血清中,反应后离心清除标本中RF3)用鸡抗体作固相抗体和酶结合物。4)酶结合物中IgG Fab’2替代IgG Fc。5)用还原剂使RF降解,2-巯基乙醇可使RF的巯基裂解。6PEG沉淀法,人γ-球蛋白预吸收法可消除RF干扰。7)用羊抗人IgG抗体、G蛋白、致敏乳胶等方法也可消除RF干扰。8)用抗人IgM抗体中和RF9)重组单克隆IgY作试剂抗体能防止干扰现象。

 血清指数(溶血、黄疸、酯血)

1。 产生原因  机体疾病是体内溶血、黄疸、脂血产生的主要原因。自身免疫性疾病引起自身免疫性溶血;肝胆疾病、自身免疫性溶血引起胆红素升高;脂肪代谢紊乱、高脂饮食。输注脂肪乳等可引起高脂血症。

2. 产生的干扰及机制 溶血对分析的影响取决于分析方法,其干扰程度与检测方法、抗体特异性、溶血程度有关。溶血时红细胞破坏释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白,在以辣根过氧化物酶为标记物的ELISA法分析中,导致非特异性显色,出现假阳性结果。

3。解决方法 1)将血红蛋白或胆红素相应抗体结合到聚苯乙烯微球与血清反应,离心将血红蛋白或胆红素清除。2)胆红素氧化酶可降低或消除胆红素的干扰。3)空腹采血、超滤、高速离心、乙醚提取法、环糊精脱脂法等可降低脂血影响。4)可用PEG沉淀含载脂蛋白B的脂蛋白。5)使用脂质澄清剂与标本按一定比例进行混合。

 其他蛋白

补体、溶菌酶、副蛋白和结合蛋白等也对免疫分析产生干扰。

1.补体 ELISA法中固相抗体和酶结合物均可激活血清补体系统。补体可与IgG Fc片段结合,将捕获抗体和检测抗体连接起来,从而出现假阳性结果。活化补体可与固相抗体结合,封闭抗体的特异性结合位点,阻断抗原与抗体的特异性结合,导致假阴性。补体可对免疫放射测定法测定TSHhCG产生负干扰。消除方法:156℃加热30min2)紫外线照射,机械振荡;3)用鸡抗体作捕获抗体和检测抗体;4)用稀释液稀释标本;5)加入EDTA避免补体激活;6)温室存放数天再检测。

2。溶菌酶 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,广泛存在于机体体液中。溶菌酶能结合等电点较低的IgG,桥联固相抗体和酶结合物导致假阳性。卵清蛋白和铜离子等能封闭溶菌酶,防止其与IgG结合。

3。副蛋白 副蛋白是单克隆B淋巴细胞或浆细胞大量增殖产生的具有相同氨基酸序列和蛋白质结构的Ig分子或片段。副蛋白可结合检测抗体从而引起免疫分析干扰。样本与动物血清孵育离心沉淀M蛋白可消除干扰。

4.结合蛋白 激素结合球蛋白等可通过结合分析物或与分析物解离而改变分析物浓度。改变pH值、使用化学试剂可使复合物解离。

5.高浓度Ig  间接法测定IgM抗体时,血清中特异性IgG抗体可与分子较大的IgM竞争结合有限的固相抗原,造成假阴性。若存在抗IgGIgMRFRF可结合IgGRF可被抗IgM酶标记物识别造成假阳性;清除IgG 的方法:蛋白IgGFc段有高亲和力,可请除大部分IgG;离子交换层析技术;羊抗人IgG稀释液;重组琼脂糖G蛋白。

 交叉反应

如果存在与分析物结构相似的内源性物质,或分析物的代谢产物与分析物有共同的交叉反应表位均可导致免疫分析中出现交叉反应、交叉反应物与试剂抗体发生反应,相当于增加了标本中分析物的含量,可导致假阳性。交叉反应也可以导致假性低值,因为在洗涤或分离步骤中交叉反应物比分析物解离得更快。

 高剂量钩状效应

抗原抗体比例合适时两者形成的免疫复合物的量最多,当抗原过量时形成的免疫复合物的量由上升转为下降。高剂量钩状效应对ELISA、免疫比浊法的影响较大,可使高浓度标本结果降低,甚至出现假阴性结果。一步法ELISA血清与酶结合物同时加入,游离抗原与抗原-酶结合物复合物竞争结合固相抗体,部分酶结合物只与抗原形成复合物而没有形成固相抗体-抗原-酶结合物复合物从而被洗掉,导致结果假性降低。两步法ELISA分析中固相抗体与抗原反应后再加入酶结合物,一般不容易出现高剂量钩状效应,但仍可能因饱和现象低估抗原含量。消除方法:1)用稀释液对高浓度标本进行稀释;2)适当增加固相抗体和酶结合物的含量;3)设定仪器参数,自动识别高剂量钩状效应;4)反应在振动条件下进行可抑制高剂量钩状效应。

小结

当试验结果与临床症状不一致时,或患者曾接受动物制剂诊断或治疗,或有类似试验干扰史时应积极评价内源性干扰。试验人员应加强与临床医生沟通,获取患者相关信息。加强继续教育,使试验人员充分了解内源性干扰。临床医生也应充分认识内源性干扰对试验的影响,正确评价试验结果,避免被试验结果误导。 

 

 

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